Faire soi-même du séquençage ADN à la maison
(bradleywoolf.com)- Pour les personnes qui veulent tenter le séquençage de génome avec du matériel personnel, la procédure concrète de home lab, du prélèvement de cellules buccales jusqu’à l’analyse VCF, et l’équipement nécessaire sont présentés en un seul fil
- Les cellules de l’intérieur de la joue utilisées comme échantillon expérimental sont faciles à obtenir, mais elles ne conviennent pas aux questions qui nécessitent un contexte tissulaire, comme le diagnostic du cancer ou l’analyse de l’inflammation et de l’expression génique dans un tissu précis
- La valeur des données génomiques réside moins dans l’obtention d’un diagnostic immédiat que dans la transformation du VCF en couche de référence interrogeable, afin d’explorer les variants avec VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude, etc.
- La préparation a pris environ deux mois, et le MinION seul coûte environ 7 500 dollars ; en tenant compte du matériel, des réactifs, des consommables et de l’environnement d’analyse, la barrière financière reste donc élevée pour un particulier moyen
- Une exécution à faible input et faible couverture doit être considérée comme une validation technique, et non comme une interprétation de qualité médicale ; il est important de ne pas surinterpréter les variants à faible couverture
Portée et limites du séquençage ADN à domicile
- Se base sur l’expérience de séquençage de son propre génome à 5 reprises avec un Oxford Nanopore Technologies MinION
- Prélèvement de cellules à l’intérieur de la joue avec un écouvillon
- Préparation de l’échantillon pour le séquençage
- Chargement sur le séquenceur
- Analyse des données obtenues
- Les cellules buccales sont faciles à obtenir et se renouvellent rapidement, mais ne conviennent pas à toutes les questions biologiques
- Elles ne sont pas utilisées pour le diagnostic du cancer
- Elles ne sont pas adaptées au diagnostic d’une inflammation ni à l’identification de gènes activés dans d’autres parties du corps
- Pour observer les gènes exprimés dans les cellules inflammatoires d’une zone d’urticaire sur la poitrine, il faut comparer les cellules problématiques à des cellules normales
- La préparation complète a pris environ deux mois, et le coût reste encore difficilement accessible pour un particulier moyen
- Les coûts diminuent
- À long terme, il estime que des technologies capables d’indiquer en temps réel l’expression de l’ADN et de l’ARN, comme le téléphone mobile ou l’IA, deviendront possibles
Ce que l’on peut faire avec des données génomiques
- Le génome n’est pas « magique » : c’est une couche de référence, et avec un VCF, on peut l’interroger à l’aide de divers outils
- Les outils utilisables incluent VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude, etc.
- À partir d’un VCF, on peut explorer les questions suivantes
- Quels variants possède-t-on ?
- Quels gènes et quelles voies sont affectés ?
- Quels médicaments pourrait-on métaboliser différemment ?
- Quels variants rares faut-il examiner sérieusement ?
- Quelles sont les zones que le modèle ne connaît pas encore ?
- Les informations produites ne sont pas encore de niveau diagnostique
- Il ne s’agit pas non plus de conclure : « puisque l’IA l’a dit, éditez-vous vous-même avec CRISPR »
- La valeur à court terme réside dans la transformation d’un génome statique en une forme interrogeable
- L’ADN est une référence stable, l’ARN est plus proche de l’état actuel, et à long terme, il estime que les données de biocapteurs pourront être intégrées dans un modèle personnel unique
Matériel et consommables nécessaires
- Le matériel central est l’Oxford Nanopore Technologies MinION, au prix de 7 500 dollars
- Un ordinateur portable ou une station de travail pour exécuter MinKNOW
- Au moins 100 Go de stockage pour les sorties
- Un GPU pour le basecalling avec Dorado
- Vortex, heat block, centrifugeuse
- Les principaux consommables incluent un kit de séquençage ONT, un kit de lavage de flow cell, du matériel de contrôle, du PBS et des écouvillons buccaux
- Les réactifs se répartissent entre extraction d’ADN, préparation de librairie, priming de flow cell et quantification
- NEB Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood: 87 dollars pour 5 exécutions
- NEBNext Companion Module v2: 760 dollars pour 24 réactions
- Oxford Nanopore SQK-LSK114: 720 dollars pour 6 réactions
- nuclease-free water, Qubit fluorometer, Qubit dsDNA BR ou HS Assay Kit
- Des équipements de paillasse et consommables plastiques sont également nécessaires séparément
- microcentrifuge, magnetic rack, tube racks, ice bucket, -20°C freezer, 4°C fridge, pipettes
- sterile cheek swabs, LoBind tubes, PCR tubes, Qubit assay tubes, filtered tips, wide-bore P200 tips, gloves
Déroulé expérimental : du prélèvement à la librairie finale
- L’objectif global est de transformer 2 échantillons par écouvillon buccal en une librairie séquençable sur MinION
- La phase de préparation comprend le port de gants, le nettoyage de la paillasse, l’étiquetage des tubes, la mise à température ambiante des AMPure XP beads, le maintien des enzymes au froid, le réglage du heat block à 56°C et la vérification des réactifs ONT
- Le prélèvement et la concentration des cellules consistent à gratter l’intérieur de la joue pendant 60 secondes, à placer l’échantillon dans du PBS, puis à obtenir par centrifugation un petit pellet blanc ou gris-blanc
- Le PBS peut devenir légèrement trouble
- Il est important de ne pas aspirer le pellet
- Avec le kit Monarch, les cellules sont lysées et l’ADN est lié aux capture beads
- Après la lyse, la priorité est de préserver l’ADN de haut poids moléculaire ; il ne faut donc pas utiliser de vortex
- Il ne faut pas perdre les beads auxquelles l’ADN est lié
- De l’ethanol doit déjà avoir été ajouté au gDNA Wash Buffer
- L’ADN génomique purifié est quantifié avec Qubit
- Utilisation de 1x dsDNA High Sensitivity
- Si la concentration de l’échantillon est trop faible, refaire la mesure dans un nouveau tube Qubit avec davantage d’ADN
- Ajouter simplement de l’ADN au tube existant fausse le calcul de l’assay
- Le meilleur moment pour faire une pause est juste après l’extraction d’ADN
- Étiqueter clairement un tube DNA LoBind
- Après un quick spin, conserver au réfrigérateur à 4°C, sans vortex
Préparation de librairie et chargement de la flow cell
- L’input idéal pour le repair/end-prep est de 1 000 ng d’ADN dans 47 µL
- Si l’ADN est trop dilué pour atteindre 1 000 ng dans 47 µL, utiliser le volume maximal possible
- Un premier exemple d’exécution à faible input était de 0,296 ng/µL × 47 µL, soit environ 13,9 ng ; c’était très inférieur à l’input recommandé, mais utile pour s’entraîner de bout en bout
- Le repair/end-prep utilise FFPE DNA Repair Buffer v2, FFPE DNA Repair Mix et N-Prep Enzyme Mix
- Salt-T4 DNA Ligase n’est pas utilisé à cette étape, mais plus tard
- Si l’on n’utilise pas DCS, remplacer le 1 µL optionnel de DCS par du nuclease-free water
- Après cleanup AMPure, les adaptateurs ONT sont ajoutés par adapter ligation
- La réaction contient le repaired/end-prepped DNA, LNB, Salt-T4 DNA Ligase et LA
- Sans LA, aucune librairie séquençable n’est produite
- Sans Salt-T4 DNA Ligase, l’adapter ligation échoue
- Si LNB n’est pas correctement mélangé, la chimie de ligation se dégrade
- Le vortex est évité, car il peut provoquer un cisaillement de l’ADN
- Le cleanup de l’adapter-ligated library utilise LFB, et non de l’ethanol
- La règle pratique est : « Liquid moves. Beads stay. »
- Les beads ne sont pas transférées dans la librairie finale
- La librairie finale est de nouveau quantifiée avec Qubit
- Une exécution à faible input peut donner une valeur basse ou échouer
- Lors d’une exécution d’entraînement, on peut poursuivre avec le loading mix à partir de 12 µL de library sans consommer la library de façon répétée dans Qubit
Exécution MinION et traitement des données
- Dans MinKNOW, vérifier la flow cell et noter le nombre de pores actifs
- Plus de 1 200 : bon
- 800–1 200 : utilisable
- 500–800 : limite ou pour l’entraînement
- Moins de 500 : mauvais, mais l’entraînement mécanique reste possible
- Moins de 200 : pratiquement peu de valeur, sauf pour s’entraîner au chargement
- Trois tubes sont manipulés à l’étape finale
- Final library: DNA library après cleanup des adaptateurs
- Priming mix: pour préparer la flow cell
- Loading mix: contient la final library, le sequencing buffer et les library beads
- La flow cell comporte deux ports
- Priming port: sous le sliding cover, reçoit le priming mix
- SpotON sample port: petit sample well dans lequel le loading mix est déposé goutte à goutte
- La Final library n’est pas déposée directement sur la flow cell : elle est d’abord ajoutée au loading mix tube
- Les réglages de base de MinKNOW sont les suivants
- Flow cell type: FLO-MIN114
- Kit: SQK-LSK114
- Basecalling: ON
- Model: High-accuracy / HAC
- Barcoding: OFF
- Alignment: OFF
- Adaptive sampling: OFF
- Raw reads / POD5: ON
- Filtering: OFF pour une exécution d’entraînement à faible input
- Pour une exécution d’entraînement à faible input, il est recommandé d’activer le raw POD5 afin de pouvoir l’analyser plus tard, même si la sortie live est mauvaise
Pipeline d’analyse
- Si nécessaire, effectuer le basecalling après l’exécution avec Dorado
dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam- Si nécessaire, conversion en FASTQ avec
samtools fastq calls.bam > reads.fastq - Pour une première vérification rapide, HAC peut être utilisé à la place de SUP
- Pour la référence humaine, utiliser GRCh38 FASTA
- Créer un index de référence avec minimap2
- Aligner les reads avec
map-ont - Produire l’index BAM et flagstat avec samtools, puis vérifier la couverture avec mosdepth
- L’appel de variants utilise Clair3 et un modèle ONT
- La sortie doit inclure un VCF
- Ne pas surinterpréter les variants à faible couverture
- La première exécution MinION doit être traitée comme une validation technique, et non comme une interprétation de qualité médicale
- L’annotation consiste à installer VEP et à annoter le VCF sur la base de GRCh38
- Ajouter ClinVar, gnomAD et PharmGKB
- Le tableau final inclut chromosome, position, ref, alt, gene, consequence, ClinVar significance, gnomAD frequency, genotype, read depth, variant quality
Ressources de référence
- Seth Howes protocol: ressource de référence sur les coûts et le protocole pour séquencer un génome à domicile
- Quantifying Life: présenté comme une ressource très sous-estimée
- Integrated Drug Discovery Technologies: présenté comme ouvrage de référence
1 commentaires
Avis de Hacker News
Je n’ai pas envie de faire le séquençage moi-même à la maison, mais j’aimerais essayer via un service tiers qui fournit l’intégralité des données brutes.
Je suis un consommateur ordinaire vivant en Europe, et je serais curieux d’avoir des recommandations sur les services à utiliser. Ce serait un gros avantage si le prestataire ne conservait pas les données, mais je ne sais pas si l’on peut aller jusque-là dans les exigences.
Voir la fuite de 23andMe : https://en.wikipedia.org/wiki/23andMe_data_leak
Sur demande, ils font aussi du séquençage du génome entier en haute résolution. En revanche, c’est long, et ils disent se réserver le droit d’annuler la commande si vous vous plaignez des retards. Ce n’est pas l’option la moins chère, mais du point de vue de la vie privée pour les Européens, je trouve que c’est plutôt pas mal. Plus la confidentialité compte, plus un prestataire un peu « difficile à gérer » peut finalement être préférable.
Il disait l’avoir fait lui-même dans plusieurs pays, mais je ne sais toujours pas si les gens l’aidaient à cause de son titre. Il était toutefois convaincu qu’on pouvait trouver quelqu’un prêt à aider même en étant simplement ingénieur logiciel. S’il y a un labo près de chez vous, ça vaut le coup d’essayer.
La principale raison de mon choix était qu’ils avaient alors une offre bon marché à 30 euros.
J’ai besoin de longues lectures parce que l’information que je cherche se trouve dans des gènes dupliqués presque identiques. J’ai bien des fichiers FASTQ et BAM de Dante Labs, mais je n’ai pas réussi à en extraire l’information voulue.
Je ne comprends pas ce que signifie cette histoire quasi magique : « le document est conçu pour être lu par une IA, copiez l’URL dans ChatGPT et laissez-vous guider. Avec des lunettes AR, c’est encore mieux, l’IA peut vous accompagner tout au long du protocole ».
On peut aussi le lire soi-même, mais le contenu est assez dense.
J’avais déjà envisagé une entreprise qui récupérerait des racines dans les canalisations, les identifierait par séquençage si nécessaire, puis indiquerait quelle plante tuer avant que la canalisation ne s’effondre.
Si cela permettait de repousser de quelques années un remplacement de canalisation à 10 000 dollars, je pense que beaucoup de gens paieraient 100 dollars.
https://www.envirodna.com/
https://www.naturemetrics.com/species-detection
https://www.ednacollab.org/industry/
https://wilderlab.co/
Ces entreprises se concentrent sur l’ADN environnemental. Certaines relèvent plutôt du suivi pour les collectivités locales, d’autres visent aussi les clients particuliers.
Je ne vois pas bien pourquoi ce serait nécessaire. En quoi une méthode pour tuer une plante précise serait-elle meilleure qu’une méthode ciblant toutes les plantes susceptibles d’être présentes ? On pourrait combiner plusieurs types de traitements herbicides, et j’imagine que ces options seraient moins chères que ce service.
C’est une idée vraiment intelligente, et si les conditions étaient réunies, je paierais clairement pour ça.
Cela dit, en y réfléchissant, est-ce qu’un herbicide biodégradable à large spectre versé dans l’évacuation ne permettrait pas d’obtenir le même effet pour moins cher ?
Je me demande quelle approche permettrait de faire connaître le service et d’amener suffisamment de gens à commander. Ça fait penser à une opportunité commerciale minimale viable.
Il est déjà difficile de faire venir un plombier chez soi pour moins de 100 dollars. Je me demande si vous vouliez dire 500 dollars, ou si les 100 dollars ne concernent que la partie analyse en laboratoire.
J’aimerais qu’il y ait une discussion sur les résultats. Les précédents retours sur ce capteur et ce processus étaient assez mitigés.
Le processus lui-même est chouette, mais j’aimerais savoir à quel point les résultats obtenus en conditions réelles sont exploitables.
https://www.the-odin.com/whole-genome-sequencing-30x/
Pour faire vite et relativement bon marché, il existe une option à 599 dollars.
Pour 7 500 dollars ou plus, on peut obtenir une confidentialité garantie. Les autres aspects peuvent varier comme l’indiquent les commentaires, mais au moins les données ne quittent pas la maison.
Je veux faire du séquençage, mais je ne veux qu’aucune entreprise, aucun gouvernement ni aucune organisation religieuse puisse accéder à mes données.
Quand l’auteur dit que « si l’on dispose d’un VCF, on peut le faire passer dans des outils comme VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector ou Claude », mes données ne finissent-elles pas justement entre les mains des entités que je veux éviter ?
En revanche, avec Claude, oui, vous transmettez bien vos données. Mais cette étape n’est pas indispensable. En exécutant un pipeline standard, on obtient un fichier VCF contenant les variants génomiques, puis on peut annoter chaque variant. En examinant les gènes annotés, on peut déterminer si un variant est pathogène, probablement pathogène, peu susceptible d’être pathogène, ou bénin.
C’est vraiment incroyable qu’un objet de la taille d’une paume puisse faire ce genre de chose. Si un appareil CRISPR de taille similaire arrive aussi, on sera en plein scénario de Gattaca, donc il va peut-être falloir s’arrêter là.
J’ai déjà extrait et séquencé de l’ADN en laboratoire humide, même si c’était il y a près de 20 ans, et ce travail est difficile et échoue souvent. En particulier, sans environnement extrêmement propre, les échecs sont encore beaucoup plus fréquents.
Même une fois les données obtenues, il faut se demander à quel point elles sont exactes compte tenu des conditions de collecte, et examiner aussi les erreurs de séquençage corrélées qui n’auraient pas été prises en compte. Par ailleurs, le conseil génétique est un vrai domaine de spécialité que des gens étudient sérieusement. Avant de demander à un grand modèle de langage ce que vos données génétiques signifient pour vous, il faudrait pouvoir accéder à quelqu’un capable de contextualiser ces données et de vous mettre en relation avec les spécialistes pertinents. Même avec un doctorat dans ce domaine, je ne serais pas sûr de pouvoir interpréter mes propres données de manière froide et rationnelle.
Au passage, je ne comprends pas pourquoi le lien vers Molecular Biology of the Cell pointe vers la 6e édition plutôt que la 7e, sortie il y a quatre ans. Pour les trois premières éditions, mon directeur lors de mon premier doctorat en était coauteur ; c’est lui qui a montré que l’idée de Roger Penrose selon laquelle les microtubules jouaient un rôle important dans la chimiotaxie d’E. coli était complètement absurde. C’était quelqu’un de remarquable. En 2007, j’ai analysé des données Illumina qui étaient alors très précoces commercialement, et comme on pouvait les aligner sur un génome de référence, il était possible d’identifier certains biais. La technologie nanopore présente très probablement davantage de biais de ce type, et si l’on n’est pas capable d’en tenir compte, on peut se retrouver dans de sérieux ennuis.
C’est aussi mon avis en tant que titulaire d’un master en biochimie.
Au lieu de passer par une entreprise de génomique personnelle, on peut aussi confier le travail à une société qui propose des services de séquençage externalisés aux laboratoires. Je suis entièrement d’accord sur les risques liés à l’interprétation.
J’apprécie l’attention portée à la confidentialité. Mis à part le problème évident du « passage dans Claude », je me demande combien des outils d’analyse mentionnés sont entièrement open source, ou au moins capables de fonctionner en local.
J’aurais aimé que l’article traite ce point.
Comment savoir si les résultats que j’ai obtenus sont réels, ou si ce ne sont que des données inutilisables ?